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Multi-Protein Quantitation Workflow 新模块上线 Byos®多蛋白定量工作流程-Multi-Protein Quantitation Workflow正式上线了，适合需要定量成千上万个蛋白质样本的生物制药研究人员。这个工作流实现对生物医药研发全周期的HCP监控——早期细胞系开发，工艺优化，抗体纯化，上市申请等。 MPQ模块可对数千种蛋白质进行稳定的定量，快速分析千兆字节的原始数据，方便在Byos®可视化界面进行数据审查。此外，MPQ可通过分析质谱仪的精度和分辨率以及酶消化效率，快速评估样品制备质量。MPQ基于成熟且经过验证的搜索算法，通过简单的以蛋白质为中心的计算逻辑，实现蛋白质组范围内的蛋白质鉴定。 使用Protein Metrics Byosphere®云平台的客户可以利用软件中的deep query和dashboard功能，快速比较多样本、同项目、不同site之间的数据，实现数据分析的高度可重复性。同时， Byosphere®中的MPQ可支持GxP/合规性的要求。 Protein Metrics 总裁Eric Carlson表示：“此次发布将扩展我们的产品，服务于更广泛的蛋白质组学应用场景，从而吸引更多的用户。我们的用户越来越有兴趣比较不同样本和项目中的蛋白质谱，并利用这些数据为预测模型提供信息，以加速开发。” 定量可实现 • 自动过滤目的PSM • 复杂蛋白质混合物的即时分析 • 数千种蛋白质的无标记定量 • 样品间一致的Top N肽段 • 以蛋白质为中心的分析 • 自动计算和应用重复样品的RSD 定性可实现 • 使用世界领先的算法准确识别蛋白质 • 快速搜索大型蛋白质组 • 生成数千个蛋白质ID • 将多个原始文件处理为单个报告 联系我们 更多发现及功能演示，欢迎联系 Protein Metrics 中国区负责人：王蕾 联系方式：13482181958 关于 Protein Metrics Protein Metrics LLC是一家全球领先的质谱数据解析软件供应商，公司总部位于美国波士顿。我们为科研和企业用户提供高效准确的一站式质谱数据解析方案，帮助用户发现、解决问题。Protein Metrics在全球范围内提供销售和支持，目前已为超过200个企业和300个科研单位提供服务。

Protein Metrics 中国用户会 【报名通道开放中】 时间：2024年11月6日 09:15 – 16:15 地点：上海市浦东新区盛荣路88号 盛大天地源创谷会议中心-恒星厅 报名通道 即刻扫描下方二维码预定席位 或点击文末 “阅读原文” 轻松报名 会议精彩日程 前沿分享 上午时段，我们将呈现一系列精心策划的主题报告，涵盖抗体偶联药物、寡核苷酸、糖组学等当前科研与产业的热门领域，与您一同探讨前沿的科研成果与行业洞察。 实操盛宴 下午时段，Protein Metrics国内外的资深技术专家将通过理论讲解与实操演练相结合的模式，让您亲身体验质谱分析软件的魅力。实操培训亮点包括： ADC药物重建 掌握抗体偶联药物（ADC）的高效分析与重建技巧。 Digested Oligo Bottom-Up 分析 如何将复杂核酸样本分解为小核苷酸片段，进行精准bottom-up分析。 特别提示： 参加实操培训的老师们，请自备电脑，Protein Metrics将为您现场安装并激活软件。实操涵盖“肽图分析(Peptide)”、“分子量分析(Intact)”及“长链核苷酸模块(Digested Oligos)”三大核心模块。为确保效果，建议使用i7及以上CPU的电脑，具体电脑配置见下图。 总部演讲嘉宾 Stephen Cypes VP Global Sales and Services Protein Metrics LLC Lawrie Veale Mgr. of CS; Mgr. of Global Vendor Partnerships Protein Metrics …

Protein Metrics 2024年中国用户会火热报名中！ Read More »

Protein Metrics 中国用户会 【邀请函】 时间：2024年11月6日 地点：上海市浦东新区盛荣路88号 盛大天地源创谷会议中心-恒星厅 诚邀您的莅临 尊敬的用户及各位老师： 您好！ 我们非常荣幸地宣布，2024年度Protein Metrics用户会将于2024年11月6日盛大召开，我们诚挚地邀请您拨冗出席。期待与您在会上交流合作！ 会议亮点 前沿分享：上午时段，我们将呈现一系列精心策划的主题报告，涵盖抗体偶联药物、寡核苷酸、糖组学等当前科研与产业的热门领域，与您一同探讨前沿的科研成果与行业洞察。 实操培训：下午时段，Protein Metrics 本地及国外的资深技术专家将通过授课与实操培训相结合的模式，让您亲身体验质谱分析软件的魅力。实操培训亮点包括： ADC药物重建：掌握抗体偶联药物（ADC）的高效分析与重建技巧 Digested Oligo Bottom-Up分析：学习如何将复杂核酸样本分解为小核苷酸片段，进行精准bottom-up分析。 为确保每位参与者都能获得最佳的学习体验，请所有参加实操培训的老师自备电脑以便更深入地参与互动与实践。 参会指南 时间 2024年11月6日（全天） 地点 上海市浦东新区张江镇盛荣路88弄盛大天地源创谷会议中心-恒星厅 日程安排 上午：主题报告；下午：实操培训 注意事项 请参加实操培训的嘉宾自备电脑，无需预装软件。我们将提供现场安装与激活服务。 电脑配置基本需求已列出，请确保您的设备符合要求。 会议议程 主题报告 09:15AM Registration 09:35AM Welcome and Introduction Thomas Blackadar, 拜诺维讯信息科技（上海）有限公司 Steve Cypes, Protein Metrics, LLC 09:45AM Roadmap and What’s New Steve Cypes, Protein Metrics, …

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第五期 一口气讲完 糖肽搜索引擎 Protein Metrics 高准 Database search engine Glycan-first search engine Peptide-first search engine 本文简要介绍糖肽搜索引擎的分类和特点，帮助分析学家快速了解各类搜库软件。 简介 糖肽表征需要确定多肽序列，糖基化位点以及聚糖的组成和结构。与其他翻译后修饰不同，糖基化引起的质量增加通常大于2~3个氨基酸，往往会与漏切肽段或共享碎片离子但序列不同的肽段相互混淆，造成糖肽匹配错误；手动解析费时费力，无法推广到大规模糖肽组学。因此，科学家们开发了大量的糖肽搜库软件以实现自动化的糖肽分析。 按照搜库原理，糖肽搜索引擎大致可以分为3类：database search, glycan-first和peptide-first。Database search需要提供蛋白数据库和聚糖库，通过组合多肽和聚糖信息与串联质谱数据进行匹配，灵敏度高；后两类将糖肽串联质谱数据分割成多肽和聚糖两部分，先完成其中一个搜库，并以此为基础限制另外一个搜库空间，速度快。 01 Database search engine Database search engine将糖肽作为一个整体进行搜索，这就意味着需要考虑所有可能的多肽和聚糖组合。这种搜索的复杂性，往往需要限制蛋白质和聚糖数据库大小，以便在合理的时间内完成搜库。但随着质谱技术和AI技术发展，database search engine的速度得到了大幅度的提高。以Byonic为例，可利用B离子筛选出糖肽二级谱和isobar_score_filter=50智能打分系统过滤掉质量差的糖肽二级谱，最终加快搜库速度并给出高质量的糖肽结果。 在2021年，HUPO启动了糖肽信息化解决方案评估，有众多软件的开发者和用户参与。其中Byonic的N/O糖搜库性能最好，并得益于用户友好界面，精确的图谱标识和灵活的报告模板，Byonic拥有最广泛的用户基础。 02 Glycan-first search engine Glycan-first的典型特征是先用Y离子确定肽质量，并以此来限制肽的搜库空间。MAGIC和pGlyco是这个算法的典型代表，但实现方式不同。 pGlyco3采用两步法，首先使用Y离子和B离子将完整的聚糖与聚糖数据库进行匹配，然后利用前体离子质量减去聚糖质量来确定肽质量，从而在大大减少的搜索空间中匹配肽序列。 MAGIC采用三步法，首先利用五糖核心系列Y离子推测肽质量，然后在限制的搜库空间中匹配肽序列，最后深入表征聚糖的组成和结构。由于三步法依赖五糖核心，该算法主要用于N糖搜库。 03 Peptide-first search engine MSFragger-Glyco是Peptide-first的典型代表，首先利用b/y离子进行肽匹配，然后利用前体离子质量减去肽质量来确定聚糖质量，最后在大大减少的搜库空间中匹配聚糖的组成和结构。与Glycan-first相比，该方法不依赖于Y离子，因此可以大大提高O糖的搜索灵敏度。 糖肽搜索引擎示例 结语 本文是糖蛋白系列文章完成篇，系统介绍了糖肽搜索引擎的分类和特点，方便科研和企业用户选择适合自己的软件。 参考文献： [1] Polasky, Daniel A., and Alexey I. …

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第四期 解析糖肽搜库结果 Protein Metrics 高准 一般思路 搜索设置 检查肽段组 评估MS2 MS2质谱示例 本文主要介绍糖肽搜库结果的解析思路，帮助分析学家从复杂的质谱数据中快速筛选出正确的糖肽结果。 01 一般思路 由于糖基化的复杂性，分析学家需要从更广泛的视角进行数据判别，包括聚糖的数据库选择，生物学意义，MS2光谱等。 当您获得了糖肽搜库结果，可按照如下步骤进行数据分析： 首先根据肽段对结果进行排序，再根据保留时间进行排序。您可以将肽段的电荷态Combine，看看其分布是否符合预期？ 查看肽段组的聚糖是否与某个合理的构建途径相关？糖肽的保留时间是否合理？ 检查那些归属不明确的MS2，以确保分配了正确的聚糖。糖基化的肽段往往会导致肽骨架的碎裂效果不佳，因此仅依靠打分来进行解析可能会忽略掉一些真正的阳性谱图。因此，通常需要对MS2质谱图进行手动解析。 02 搜索设置 选择正确的数据库：一种组织表达系统可能会产生与另一种系统不同的聚糖。最常见的错误原因之一，就是正确聚糖不在搜库范围内。 03 检查肽段组 聚糖生物学意义 查看组中评分最高的结果，并确保所有其他结果在该背景下都有意义。 肽段组中鉴定出的聚糖相互之间是否存在依存关系？如您经常会在同一位点看到高甘露糖和复杂的唾液酸化形式。 糖肽保留时间 NeuAc和其他唾液酸可导致色谱峰向更酸性的区域偏移。您在数据中看到这种情况了吗？如果没有，则表明鉴定结果可能存在问题。 评估其他通过洗脱时间提供的信息，例如当取代基（如唾液酸）从一个天线移动到另一个天线时出现的双峰。 04 评估MS2 在大多数糖肽的碰撞MS2质谱中，您应能看到 HexNAc (204) 和 HexNAcHex (366) 的信号。如果您没有看到这些碎片，但是鉴定结果包含这些结构单元，可能就不是糖肽。 确保肽段的N端和C端正确。如果末端不正确，那么一个被认为是截短的肽段可能实际上是一个全长肽链，只是携带了不同的糖基修饰。寻找覆盖末端的 b/y 离子；或者携带小聚糖碎片的完整肽，在合适的能量下进行HCD/QTOF碎裂，Y0和Y1均为可靠的峰。 仔细检查Delta Score较低的谱图，因为这表明Byonic找到了另一种不同的匹配结果。 请注意标有波浪号（例如 ~y5）的碎片，这表明这些碎片已经完全丢失了聚糖（或其他不稳定的物质）。虽然这是合理且预料之中的，但在缺乏其他确认信息的情况下，这也有助于定位糖基化位点。 05 MS2质谱示例 结语 本文介绍了糖肽二级谱的解析思路和方法，致力于提供高质量的糖肽结果。后面还有更多精彩内容，敬请期待吧！ 关于Protein Metrics Protein Metrics LLC是一家全球领先的质谱数据解析软件供应商，公司总部位于美国波士顿。我们为科研和企业用户提供高效准确的一站式质谱数据解析方案，帮助用户发现、解决问题。Protein Metrics在全球范围内提供销售和支持，目前已为超过200个企业和300个科研单位提供服务。 …

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第三期 Byos中的 糖肽搜库策略 Protein Metrics 高准 数据库选择 N糖策略 O糖策略 未知糖策略 加速糖肽搜库策略 本文详细介绍了Byos中N糖，O糖和未知糖的搜库策略以及如何优化糖肽的搜库空间，帮助用户实现更好的糖肽分析。 01 数据库选择 到目前位置，数据库搜索仍然是糖肽分析最有效手段。选择合适的糖库是糖肽研究成功的第一步。Byos提供3种不同的糖输入方式：数据库，糖组成以及自定义编辑，如下所示： Byos内置大量N/O糖库，易于编辑和拓展。默认使用糖库，如果糖库不足，可按照上述方法B/C自定义添加聚糖。 Byonic 支持大量关键字，包括 HexNAc、Hex、Fuc、dHex、NeuAc、NeuGc、Pent、GlcA、IdoA、DiNAcBac、Acetyl、Sulfo、Phospho、Na 和 Sodium。如方法B表示硫酸化N糖。 如果用户做的是衍生化糖或者含有加合物，那么delta mass可以添加在方法C的additional mass单元格中。 02 N糖策略 搜索任意N糖 Byos中N糖输入方式是HexNAc(2)Hex(2)Fuc(1) @ NGlycan | common1，其中NGlycan表示NXS/T 基序。如果用户想搜索任意天冬酰胺上的 N-糖，以发现 NXC 或反向基序上的 N 糖，可用N替换NGlycan，如HexNAc(2)Hex(2)Fuc(1) @ N | common1。 18O水中脱糖 Delta:H(1)O(-1)18O(1) / +2.988261 @ NGlycan | common1 03 O糖策略 Byos中O糖输入方式是HexNAc(1) @ OGlycan …

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第二期 糖肽的RPLC -MS/MS行为 Protein Metrics 高准 RPLC行为 离子活化 糖肽裂解规律 分子重排 错误匹配来源 Byos中糖肽结果验证 本文简要介绍糖肽的RPLC-MS/MS行为，主要包括色谱保留，离子活化，质谱裂解规律，分子重排和错误匹配来源等，帮助分析学家快速读懂糖肽LC-MS/MS图谱。 01 RPLC行为 一个糖肽二级谱往往可以匹配多个不同的聚糖和肽段组合，尤其是当质谱数据质量较差（缺少特征诊断离子或者前体离子测定不正确），保留时间就为糖肽鉴定提供非常重要的互补信息。 糖肽疏水性越强，在RPLC上的保留时间越长。通常糖链上引入中性单糖，如Hex和HexNAc，会增加糖肽亲水性，导致保留减弱。不改变电荷的翻译后修饰，对保留时间影响不大，蛋氨酸氧化除外。有研究发现，如果聚糖链上存在 NeuAc 或磷酸基团，则会导致保留时间增加，因为带负电荷的 NeuAc 和磷酸基团会抵消糖肽质子的正电荷，从而与反相色谱柱更紧密地结合。 02 离子活化 目前糖肽常用的解离方法有CID，HCD和ETD等，根据需求选择合适的碎裂方法。 CID 由于解离能低和1/3 cut-off，离子阱CID主要产生Y离子，伴有少量的B离子和b/y离子。该技术可识别结合的聚糖，但无法给出准确的糖基化位点和肽序列，可用于简单样品中的糖肽分析。 HCD HCD可以生成丰富的B/Y互补离子鉴定糖部分；随着碰撞能量增加，b/y系列离子会增多，可鉴定肽部分。研究表明，HCD–MS/MS以20-30-40%的能量可生成信息量最多的聚糖和肽相关碎片离子。 ETD ETD主要产生c/z离子，可用于鉴定糖基化位点和肽序列。由于ETD效率较低，通常与HCD或者CID结合使用，即EThcD。随着离子触发技术发展，避免了ETD在非糖肽解离上浪费的反应时间。 03 糖肽裂解规律 在糖质谱命名法中，A/B/C是非还原端离子，X/Y/Z是还原端离子。 B离子是糖肽重要的诊断离子，可用于糖型判断，触发ETD，二级谱过滤等。常见的B离子，如下图所示： B离子在碰撞池中会发生进一步碎裂，通常会丢失H2O，CH2=C=O，HCOH等，我们以HexNAc为例，展示单糖的质谱裂解规律，如下图所示： 在糖肽结构中，往往是糖的还原端与肽段直接相连，因此Y离子由Peptide+Glycan两部分组成。HCD二级谱中Y离子连续的单糖丢失，可用于糖组成和拓扑结构鉴定。 04 分子重排 质子化糖肽在碰撞池中容易发生分子重排，如单糖迁移（Fuc和其他单糖）和内部残基丢失（可以是单个单糖，也可以是多个单糖，通常以中性碎片形式离去），进一步复杂化糖肽二级谱，导致糖链拓扑结构鉴定错误。全甲基化和乙酰化的糖肽也容易发生分子重排。 Y2*表示还原端第二个糖丢失，Y3Y2*表示还原端第二个和第三个糖丢失。 为了消除重排干扰，可通过去质子化糖肽或者糖肽碱金属加合物来分析糖链结构。研究表明，去质子化和碱金属加合物糖肽在质谱中不会发生重排反应。 05 错误匹配来源 常见的糖肽匹配错误来源有两个：单同位素峰鉴定错误（如NeuAc与2Fuc质量差为1）和肽段修饰分子量与单糖分子量之差相等（如氧化+NeuAc与NeuGc质量相等）。 06 Byos中糖肽结果验证 Byos软件提供多个维度自动化的糖肽结果验证指标，如MS1 Correlation，Score，PEP2D等，释放手动解谱压力，使大规模糖肽组分析成为可能。 MS1 Correlation评估实际观测糖肽同位素峰分布与理论同位素峰分布的相关性，降低单同位素峰鉴定错误导致的糖肽错配概率。Byos 3.7及后续版本引入了惩罚性打分，如NeuAc不含有274，NeuGc不含有290等，最小化修饰肽造成糖肽匹配错误。 通常Score与PEP2D搭配使用，Score > 200，PEP2D …

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第一期 糖蛋白基础入门 Protein Metrics 高准 糖蛋白生物合成 N糖分类 O糖分类 聚糖符号命名法（SNFG） N糖命名法 Byos中糖蛋白的可视化 本文简要介绍糖蛋白生物合成，糖蛋白分类，聚糖符号命名法以及N糖命名法等基本内容，帮助分析学家快速入门。 01 糖蛋白生物合成 蛋白质糖基化是指碳水化合物与多肽共价连接。碳水化合物修饰包括单个单糖和复合碳水化合物链，两者均称为聚糖。蛋白质糖基化是一种非模板化过程，由糖基转移酶介导，负责聚糖的起始或延长，以及寡糖基转移酶，负责添加整个碳水化合物链。在细胞中，糖基转移酶或寡糖基转移酶、碳水化合物转运蛋白和糖苷酶之间的复杂相互作用精细调控蛋白质上观察到的聚糖结构。 N 糖始于内质网 (ER)，其中寡糖 N2M9G3 以共翻译方式转移到新生糖蛋白的天冬酰胺残基上，该寡糖被葡萄糖苷酶和甘露糖苷酶修剪为 N2M8。随后在高尔基体中，N 糖经历进一步的修剪和延长步骤，生成多样性的 N 糖结构。 与 N 糖的共翻译开始相反，O 糖发生在折叠蛋白上，并由单糖转移到丝氨酸和苏氨酸残基上引发。某些形式的 O-糖，如 O-岩藻糖和 O-甘露糖始于内质网，而粘蛋白型 O-糖和糖胺聚糖链的生物合成始于高尔基体。 02 N糖分类 N 糖包括少甘露糖型、高甘露糖型、复杂型和杂合型等聚糖结构。 少甘露糖型聚糖在具有可变核心岩藻糖的壳二糖核心上带有一至三个甘露糖 (Man) 残基。 高甘露糖聚糖含有仅由甘露糖组成的末端分支。 复杂和杂合聚糖的触角中可能含有半乳糖 (Gal)、N-乙酰葡萄糖胺 (GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺 (GalNAc)、岩藻糖 (Fuc)、N-乙酰神经氨酰酸 (NeuAc) 和 N-羟乙酰神经氨酰酸 (NeuGc) 残基，杂合聚糖还含有未取代的末端甘露糖残基。 03 O糖分类 粘蛋白型 O 糖有八种核心结构，均由GalNAc引发，但在组成和分支结构上不同。使用代谢寡糖工程方法引入的非典型聚糖也是可能的；对于非典型聚糖，带有化学手柄（如炔烃或叠氮化物）的单糖可进行特异性标记和/或富集。 …

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复杂半胱氨酸工程化Stapled scFv中二硫键的优化和表征 Abby J. Chiang2, Elsa Gorre1, Alexander N. Barnakov1, Christopher Sauer1, Reiko Kiyonami3, Min Du3, Andy Mahan1, Hirsh Nanda1 1 Johnson & Johnson Innovative Medicine, Spring House, PA  2 Protein Metrics Inc., Cupertino, CA  3Thermo Fisher Scientific, Lexington, MA 简介 •   多特异性抗体是下一代生物治疗药物。由可变轻链 (VL) 和重链 (VH) 组成的 scFv 结构域至关重要，但其稳定性较低且容易聚集。  •   我们 (mAbs.2023) 揭示了一种 Stapled 策略，在 VL …

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Protein Metrics 简化融合蛋白Blinatumomab表征的样品制备和数据分析的Middle-down方法 Antony Harvey1, Lucy Fernandes1, Andreas Nägeli2, Magdalena Widgren Sandberg2 1Protein Metrics, Boston, MA;  2Genovis, Kävlinge, Sweden. 摘要 目的：使用靶向连接子酶切和自动化数据分析工具对融合蛋白进行Middle-down分析。新一代生物制药结构通常包含具有多个 GS 连接子的结构域以抵抗蛋白水解。使用 GlySERIAS™ 蛋白酶酶切融合蛋白 Blinatumomab 的富甘氨酸连接子，并通过 LC-MSMS 分析所得的片段。采用 Byos® 的Intact Workflow自动去卷积并鉴定碎片质量数。利用Middle-down测序来确认酶切位点。 简介和策略 融合蛋白可结合多个蛋白结构域，从而解决特定治疗难题。通常，这些结构域使用包含多个甘氨酸残基(G)的连接子或穿插有丝氨酸 (S) 的(GS) 连接子。这些连接子专为抵抗蛋白酶降解而设计，因此难以通过传统的 LC-MS 方法进行分析。 Middle-down策略： GlySERIAS™ 用于水解融合蛋白 Blinatumomab 中的柔性连接子。使用固定化酶，使连接子酶切更完全。 使用 Bruker Impact II QTOF 采集LC-MS/MS数据 ，在 Protein Metrics Intact Workflow中处理原始数据文件。 酶切片段的鉴定和序列确认 …

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