Webinar 聚焦生物类似药 主办方：Protein Metrics 主题：聚焦生物类似药 时间：9月16日 17：30 CST|3:00pm IST 报名方式：https://bit.ly/388TDnD （或点击文末’阅读原文’） 随着大分子药物的快速发展，制药公司在证明生物类似药表征流程的准确性面临着新的挑战。Protein Metrics能够为您的分析团队提供高效准确的生物药质谱表征数据分析方案。 在本次网络研讨会期间，主要介绍Byosphere如何应对这些挑战，包括： – 使用Byosphere在非GxP 和 GxP之间无缝切换以满足监管要求 – 业界公认的金标准工作流程 –无论质谱平台的仪器类型，科学家都可以创建工作流程，允许快速和准确地进行比较 点击这里阅读原文，报名参会
糖肽的分析是蛋白翻译后修饰中相对复杂和困难的一个类型。一方面能够用于糖肽分析的商业化软件非常少，另一方面，对于刚刚接触糖肽分析的技术人员来说，糖肽的复杂程度和它与常规肽段在分析上区别常常成为我们分析糖肽的拦路虎。本期的文章我们将为大家介绍一下在Byos当中我们一些常用于糖肽检索结果判定的工具和技巧，以帮助您判断糖肽搜索结果。 糖肽结果验证我们首先要有一个分析的思路，通常在做糖肽分析的时候，我们会建议大家不要急于去从最终的结果中做判断，而是回到数据处理的开始，仔细的考虑一下，你的搜库参数是否设置合理？以及你的糖链数据库的选择是否是正确的？只有在正确和合理的参数和数据库的前提下，我们对结果的验证才是有意义的，数据处理之前没有做好这些准备工作，分析数据就是事倍功半甚至徒劳而返。一切就绪，软件搜库结果满意并开始查看结果后，应该避免在一开始就关注每一条肽段和谱图，而应该结合数据对整体的结果做一个大概的判断。我们的建议比如首先可以先按肽段排序结果，然后按保留时间排序。除此之外，可以将肽段的不同电荷状态合并在一起，以查看电荷状态分布是否符合预期。然后，就可以对排序分组后的肽段数据进行第一遍分析，同样，确保保留时间对糖肽的分析也是非常有意义。后文中我们会详细介绍分析的思路。 质谱是根据肽段和修饰的分子量变化对其进行定性和匹配，但是糖基化修饰是按照生物体内固定合成途径构建的，因此，当我们查看一组糖肽的结果的时候，它们的结构是否与合理的合成途径有关？分析人员本身的生物学背景知识对于糖肽的分析来说也是非常有用的工具，对于最终修饰到功能相关的分析都是非常有意义的。 最后，才是检查MS2谱图，通过对碎片离子的确认以确保分配了正确的糖基化修饰和位点。糖基化的肽通常的肽骨架断裂效率很低，仅依靠肽段碎片打分进行验证可能会导致标准过高从而忽略了正确的糖肽谱图。因此，通常糖肽MS2谱图的判断要综合考虑肽链碎片和糖链碎片，并且需要进一步手动验证MS2谱图，通过手动验证的结果将作为糖肽结果的一部分。 搜索设置中，您可以使用“Show all N-glycans”复选框最大化糖肽的定性结果，选择之后软件将不对糖肽结果进行数据的卡值。 Byos v3.8开始，新的MS / MS过滤功能是就对于糖基化修饰的分析特别有意义。此功能使您可以创建MS / MS Peak过滤器，以排除不包含预期诊断离子的谱图。如下图所示，您可以将搜索范围缩小到仅包括一些可预测的糖链碎片离子（204或366）的MS / MS谱图。您还可以配置匹配质量容差和必须包含的预期诊断离子数目。 检索参数设置 首先，在Byos中点击“Help→Online Resources”（将打开“resource”网页），可以访问有关设置N-linked和O-linked糖基化修饰检索参数的两个相关Application Notes（如果您现在还不是我们的用户，可以通过微信公众号右下角登记信息或联系support@proteinmetrics.com获取相关应用）。 第二，选择正确的糖基化修饰数据库，一个物种会产生与另一种物种不同的糖基化修饰类型。Byos/Byonic包括几个不同的糖基化修饰数据库供您选择，包括人，哺乳动物，昆虫，真菌等。这一点特别重要，因为最常见的错误原因之一就是由于所选数据库中缺少正确的糖基化修饰类型，当缺失正确的修饰的时候，自然也不能搜索到正确糖肽。 第三，我们的数据库是开放的，易于编辑和扩展，所以您可以基于文献或您的生物学知识在原有基础上进一步修改糖基化修饰的数据库，使它更加符合您研究的需求和生物样本的实际情况。 检查肽段 首先，在Byos中按照肽段对结果进行排序。查看每一组得分最高的结果，并确保该肽段所有其他修饰结果在该情况下有意义。是否这条肽段鉴定出的所有糖基化修饰是有相关性的？比如，我们经常会在同一个位点同时看到高甘露糖和复杂的唾液酸修饰形式。 第二，在Byos中按洗脱时间排列的数据，将保留时间错误的肽段结果丢掉。 一般NeuAc和其他唾液酸可能会导致糖肽色谱出峰往酸性区域漂移几分钟。您是否也在数据中看到这种情况？如果不是，则该定性的结果可能有问题。洗脱时间也能存在其他的线索，例如当唾液酸等从一个天线移动到另一个天线时，存在双峰等现象也可以成为我们判断糖型的一个线索。 评估MS2 首先，对于软件的检索来说，得分的提高是证明匹配更好的证据，但是诊断离子也是我们判断的重要指征。 在大多数糖肽的CID或HCD的MS2谱图中，一般能够看到HexNAc（204）和HexNAcHex（366）等信号。如果您的谱图没有看到这些片段，但是具有包含这些结构单元，说明这个匹配结果可能不是该糖肽。 第二，我们需要知道同样的分子量对于糖基化修饰可能存在不同的结构组成。 对于较小的糖基化修饰，尽管质量数确实可以推测糖链组成，但对于给定的组成，可能会有多个结构。当糖链进一步增大且质量大于约4000 Th时，则可能存在质量非常接近（相距<0.1 Th）的不同糖链，这也会使鉴定变得更加复杂。 比如NeuAc可以与两个Fuc混淆，或者在一条同时有氧化修饰的糖基化肽段上可能修饰直接被认为是NeuGc而不是Oxidation+NeuAc，因此如果需要，我们应该检查是否存在274和290等特征碎片。尽管较新版本的软件（3.7及更高版本）对不包含274的含NeuAc和不包含290的NeuGc增加了惩罚性打分，以最大程度地减少错配的情况的发生，但是我们依然建议在可能的情况下分析人员应当尽可能进行人工的复核和确认。 第三，仔细检查Delta Scores和Delta Mod Scores分数较低的谱图，因为它们表明Byonic找到了另一种可以匹配的肽段结果，这个结果的差异跟打分最高的结果并不是很大。 第四，确保肽段的N-和C-末端正确。如果它们不正确，则带有糖基化修饰的截短肽可能实际是带有另一个修饰的全长肽段。对于这种情况我们可以寻找能够覆盖末端的b-和y-离子。或者寻找仍带有小的糖链片段的完整肽段，这也暗示我们拥有正确的肽段并有助于定位。一般来说使用优化能量的HCD / CID碎裂，裸肽和裸肽+GlcNAc或GalNAc是可信的峰。 第四，如果你想更加深入的确定糖型信息，可以寻找包含糖链或部分糖链的碎片离子。这些片段可能帮助你确认糖基化的位点和结构。同时请特别注意标有~的片段（例如〜y5），这些片段表示该碎片是已完全失去糖链（或其他不稳定修饰）的片段。尽管这在CID/HCD碎裂模式下是非常正常的情况，但在没有其他确认和辅助信息的情况下，这也可能表示该位点的确认可能存在问题，这在O-糖肽的分析时非常普遍。 一些样品MS2光谱 结语 一名出色的分析科学家，一方面我们需要好的软件帮助我们做判断，给我们提供更多分析数据的思路和便利性，另一方面良好的数据分析习惯对于结果也是非常重要的。一篇小小的文章可能不足以涵盖糖肽分析的方方面面，也有很多受限于作者知识的不足之处，但是如果能够在糖肽的分析中把握到上述的思路一步一步完成我们的分析结果，相信能够对大家的日常分析有一定的帮助！如果觉得有帮助欢迎大家分享点赞，如果有任何蛋白表征的数据分析软件的需求或者希望解决的数据分析问题，也可以通过公众号右下角‘联系我们-信息登记’与我们联系。
蛋白质是生命活动的载体，在生物体内发挥的至关重要的作用，是生命科学最重要的研究对象之一，目前基于质谱的蛋白质分析平台日趋完善，具有高灵敏度、高分辨率和高通量等特点，因此基于质谱蛋白定性定量技术已广泛应用于科学研究和临床检验。伴随着生命科学的发展，近二十年来，质谱技术也迎来了快速发展，质谱仪器经过不断的升级，无论在分辨率还是灵敏度上都有了质的飞跃，但是，质谱数据的解析软件却远远滞后质谱技术，因此，数据的分析成为横亘在研究人员和结果之间的瓶颈，是耗时最长，也最为头痛的难题，特别在一些复杂的蛋白质翻译后修饰研究以及蛋白的精细结构分析领域，因为缺乏准确高效的软件而无法得到准确的结果。 Protein Metrics Inc坐落于硅谷，汇集顶尖的生物技术及计算机科学，学科交融让Protein Metrics致力于解决蛋白质分析中存在的难题，我们也是全球最早提供糖肽解析软件的公司，目前Byos/Byonic在全球有上百家科研单位和国外几乎全部知名生物制药企业在使用，不断在日常的研究工作中为科学家解决蛋白分析的难题，为生物制药公司提供最佳的蛋白药物分析方案。 经过近十余年的发展，Protein Metrics建立了业内最为完善的蛋白质分析软件平台。目前，Byos平台可以无差别的处理所有主流LC-MS/MS仪器厂商数据，涵盖从蛋白质组学，分子量，翻译后修饰，蛋白高级结构，游离糖链，色谱注释等功能，全方位服务于蛋白质以及生物大分子分析的研究。 本次讲座Protein Metrics首先以糖基化修饰为例介绍Byos软件平台的功能，从蛋白水平，肽段水平，糖链水平等为大家讲解糖基化分析的完整方案。进一步的我们会基于软件的平台做是一些实际案例的数据分析过程和简单的软件介绍，包括： 分子量分析：蛋白/核酸的去卷积分析，ADC自动化分析，蛋白Clips分析，报告模板等 肽图分析：蛋白质组学，糖肽分析，PTM分析，蛋白杂质分析，自动报告等功能 蛋白高级结构分析：蛋白二硫键/Xlink，FootPrint等 殷薛飞 博士 Protein Metrics 亚太高级技术顾问 时间：2021年1月29日上午十点 地点：苏州市工业园区仁爱路199号苏州大学独墅湖校区二期云轩楼1323会议室
点击上方蓝字关注我们 Don’tMiss Our 2020 Online Workshop, Dec 17! Protein Metrics致力于为客户提供更好的生物药物的LC-MS数据分析软件平台。 目前，针对生物药物表征流程，Byos一站式分析平台已经能够无缝衔接您分析表征的各种需求：蛋白分子量分析，肽图分析，二硫键分析，序列变异分析，MAM，糖链分析，蛋白高级结构分析，质谱软件的网络版部署等等。 本次研讨会，ProteinMetrics 邀请了国内外一流的生物制药领域的专家与大家交流生物制药表征的经验，您可以获悉国内外最新的生物药物表征发展趋势以及ProteinMetrics最新的软件功能进展，共同交流对您最有意义的表征方案和功能！ 9:30 AM Log-in Online meeting 9:45 AM Welcome and Introduction 10:00AM Lei Wang, Ph.D., Takeda Lei是武田制药的的首席科学家。他获得了中科院化学所的分析化学博士。在加入制药行业之前，他曾在麻省理工学院进行博士后研究，并在康奈尔医学院担任讲师。Lei在生物质谱技术（尤其是LC-MS）进行生物标志物开发和蛋白表征方面拥有超过10年的经验。在武田制药，他的工作重点是治疗性蛋白质的高级表征，可开发性评估，杂质鉴定和高通量分析等，以确保产品质量，安全性和功效。目前，Lei是美国药典MAM专家小组成员。 Topic: Specificand confident Glycation Site mapping in Therapeutic Proteins Using AutomatedData Processing 10:30AM 汪彤丹，博士，药明生物 上海药明生物技术有限公司分析科学部副主任，药明生物质谱卓越中心主要负责人。博士毕业于中国科学院上海有机化学研究所，曾在上海交通大学医学院从事多年的基于质谱的蛋白质组学研究工作。自2016年始加入药明生物，主要从事蛋白质质谱表征，包括方法开发，结构表征比较性研究，肽谱图放行方法开发，评估，确证等。带领团队参与在研生物药的质谱表征和临床各期工艺研发，包括单抗、融合蛋白、双特异性抗体、ADC、酶、疫苗等。 演讲题目：基于质谱的生物药结构表征策略与案例分享 11:00AM Q&A 点击阅读原文注册参会，会后将从注册名单抽取幸运观众，也欢迎大家扫码加入PMI Workshop微信群，与我们交流生物制药LC-MS数据分析，会议期间微信群不定时会发送红包雨。 ✎ 联 …
非常感谢大家的关注，经过PMI与‘’SARS-CoV-2表面蛋白糖基化分析‘’文章作者的沟通，我们将于2020年五月四日举办Webinar为大家进一步介绍病毒糖基化分析相关内容。欢迎大家点击“阅读原文”注册我们的Webinar！ PMI，公众号：ProteinMetrics文献速递：SARS-CoV-2表面蛋白糖基化分析 Webinar Summary Scientists worldwide are working tirelessly to develop a vaccine for SARS-CoV-2 (the COVID-19 beta coronavirus), focusing on the humoral immune response to the spike (S) glycoprotein. Understanding the S protein’s glycosylation can reveal fundamental features of viral biology for use in the development and manufacturing of serological testing kits and potential …
Webinar: Analyzing the SARS-CoV-2 Glycan Shield with Mass Spec Read More »
Webinar Summary Testing is required to monitor modifications in biopharmaceutical development, from clone selection to manufacturing. However, current testing approaches for intact proteins are time-consuming and don’t provide real-time analytics to drive decision making. In this webinar, Eric Carlson, President and CEO of Protein Metrics, will demonstrate how the Byos® Vendor-neutral Mass Spec …
Webinar：Rapid Intact Charge Variant Analysis Coupled icIEF-MS Read More »
2020年以来，新型冠状病毒肆虐，3月11日，世界卫生组织宣布新型冠状病毒疫情已构成全球大流行。新冠病毒从发现之初，全世界科学家就开始密切关注其特性，希望能够早日对抗病毒。与新型冠状病毒致病性相关的Spike蛋白是一个高度糖基化蛋白，与病毒的侵染细胞的功能密切相关，面对高度糖基化的病毒，有科学家认为疫苗的研制也可能会因此更加的困难。 PMI的用户中不乏对糖基化研究精通的科学家，今天小编为大家介绍的就是Max Crispin课题组对新型官病毒S蛋白进行的深入的糖基化分析。 SARS-CoV-2的S糖蛋白共具有22个理论N-糖基化位点，文章中对这22个糖基化位点的修饰信息进行了定性和定量的研究。 新冠病毒的22个糖基化位点在该研究中全部发现是具有糖基化的，包括高甘露糖型，杂合型，复杂型N糖链。不同的糖基化位点也观察到其糖链修饰具有不同的特征，SARS-CoV-2上有10个位点包含大量高甘露糖型的N糖链，这与之前SARS-CoV-1 S蛋白糖基化研究的结果类似，显示了冠状病毒糖基化修饰的保守性。其余12个位点以加工过的复杂型糖链为主，其中S蛋白上的岩藻糖基双天线型结构与哺乳动物的糖蛋白结构非常类似。同时，与HIV Env和LASV GPC在内的其他病毒糖蛋白相比，SARS-CoV-2 S蛋白的糖基化程度较低，并且糖基化修饰形成的屏蔽少得多，这可能有利于诱导有效的中和抗体。 文章进一步结合SARS-CoV-2 S蛋白的三聚体Cryo-EM结构将糖基化状态映射到模拟的三维结构上，揭示了SARS-CoV-2表面糖基化修饰的分布，并根据糖链的甘露糖比例不同进行了着色。 通过上述文章的数据我们也看到了SARS-CoV-2 S蛋白的糖基化修饰的具体的种类，含量，及分布。从糖基化修饰的分析我们也看到相对于一些糖基化水平更高的病毒，SARS-CoV-2的抗体及疫苗研制会相对成功率更高，让我们可以有更大的信心战胜新冠病毒。如果您有兴趣进一步了解文章的内容，请点击“阅读原文”到biorxiv阅读文献吧！ 如果您正在进行糖基化蛋白的相关研究，欢迎您在我们公众号登记信息，使用同款软件进行糖基化研究哦！
本期Protein Metrics Insights的主要内容： 介绍MS/MS搜索结果中一个重要但鲜为人知的分值Delta Mod score（文末有彩蛋）; 展示Feature Finder的新用户界面。 1. 高级功能 Delta Mod Score 当分析翻译后修饰，序列突变，二硫键或其他肽段可变修饰时，关于肽段序列修饰位置的置信度这类有价值的信息记录在Delta Mod. Score值中。Delta Mod. Score的定义是MS/MS图谱中不同修饰匹配分数最高值与次优匹配的差值。在实际应用中，一个肽段有两个可能的修饰位点，Delta Mod. Score分值高或低表示在确定位点的修饰可信度。可信度由两个可能位点得到的MS/MS碎片离子的分布决定。 例如，FNWYVDGVEVHNAK肽段有两个天冬酰胺残基，因此有两个可能的脱酰胺可变修饰位点。在下面的MS/MS ID和谱图中，Byonic 显示脱酰胺修饰位点在第一个天冬酰胺残基上(FN[+1]WYVDGVEVHNAK)。 Delta Mod. Score的值的区间范围为0到肽段的打分值。从结果列表中，我们可以看出Delta Mod. Score等于肽段的打分值，已经达到该值可能的最高值。这表明该修饰位点的可信度非常高。在上面的谱图里可以找到有力的证据表明第一个天冬酰胺脱酰胺化了，而不是第二个天冬酰胺。这是由谱图上两个位点之间的片段佐证，即从y4到y12和b3到b11。 相比之下，下面的例子是一个含有三个天冬酰胺残基的肽段，这里MSMS ID的Delta Mod. Score为0. 尽管第一个天冬酰胺残基和第二个天冬酰胺残基之间有碎片离子，但是第二个天冬酰胺残基和第三个天冬酰胺残基之间没有碎片离子。因此这个修饰位置不可信，脱酰胺化可能发生在第二个天冬酰胺残基和第三个天冬酰胺残基之间，但是谱图中找不出相关证据。值得注意的是：这并不表示是假阳性的ID。这个肽段的脱酰胺化是毫无疑问的，只是不确定肽段序列上哪些位点发生了脱酰胺化。 Delta Mod Score在序列变异分析中是一个非常有用的数值，尤其是对于有多个可能修饰位置的肽段来说尤其重要。在Byos肽谱分析工作流、Byonic Viewer和Byologic项目中都能计算Delta Mod Score。 如果大家想了解更多关于Delta Mod Score干货，请扫描下面二维码报名4月9号（周四）下午2点的网络会议，听Protein Metrics中国技术专家在线解读。报名成功后，会收到Cisco Webinar链接。 2. 新功能展示 V3.7 中Feature Finder的新用户界面 最近发布的V3.7版本中更新了肽谱分析中Feature Finder算法的使用界面。 Feature Finder扫描一个样品中所有可能的肽段信号的MS1信息。使用Feature Finder能够确保所有峰都会监测到，包括没有被MS/MS鉴定到的峰和in-silico peptides方法鉴定到的峰。Feature …
本期Protein Metrics Insights的主要内容： 介绍MS/MS搜索结果中一个重要但鲜为人知的分值Delta Mod score（文末有彩蛋）; 展示Feature Finder的新用户界面。 1. 高级功能 Delta Mod Score 当分析翻译后修饰，序列突变，二硫键或其他肽段可变修饰时，关于肽段序列修饰位置的置信度这类有价值的信息记录在Delta Mod. Score值中。Delta Mod. Score的定义是MS/MS图谱中不同修饰匹配分数最高值与次优匹配的差值。在实际应用中，一个肽段有两个可能的修饰位点，Delta Mod. Score分值高或低表示在确定位点的修饰可信度。可信度由两个可能位点得到的MS/MS碎片离子的分布决定。 例如，FNWYVDGVEVHNAK肽段有两个天冬酰胺残基，因此有两个可能的脱酰胺可变修饰位点。在下面的MS/MS ID和谱图中，Byonic 显示脱酰胺修饰位点在第一个天冬酰胺残基上(FN[+1]WYVDGVEVHNAK)。 Delta Mod. Score的值的区间范围为0到肽段的打分值。从结果列表中，我们可以看出Delta Mod. Score等于肽段的打分值，已经达到该值可能的最高值。这表明该修饰位点的可信度非常高。在上面的谱图里可以找到有力的证据表明第一个天冬酰胺脱酰胺化了，而不是第二个天冬酰胺。这是由谱图上两个位点之间的片段佐证，即从y4到y12和b3到b11。 相比之下，下面的例子是一个含有三个天冬酰胺残基的肽段，这里MSMS ID的Delta Mod. Score为0. 尽管第一个天冬酰胺残基和第二个天冬酰胺残基之间有碎片离子，但是第二个天冬酰胺残基和第三个天冬酰胺残基之间没有碎片离子。因此这个修饰位置不可信，脱酰胺化可能发生在第二个天冬酰胺残基和第三个天冬酰胺残基之间，但是谱图中找不出相关证据。值得注意的是：这并不表示是假阳性的ID。这个肽段的脱酰胺化是毫无疑问的，只是不确定肽段序列上哪些位点发生了脱酰胺化。 Delta Mod Score在序列变异分析中是一个非常有用的数值，尤其是对于有多个可能修饰位置的肽段来说尤其重要。在Byos肽谱分析工作流、Byonic Viewer和Byologic项目中都能计算Delta Mod Score。 如果大家想了解更多关于Delta Mod Score干货，请扫描下面二维码报名4月9号（周四）下午2点的网络会议，听Protein Metrics中国技术专家在线解读。报名成功后，会收到Cisco Webinar链接。 2. 新功能展示 V3.7 中Feature Finder的新用户界面 最近发布的V3.7版本中更新了肽谱分析中Feature Finder算法的使用界面。 Feature Finder扫描一个样品中所有可能的肽段信号的MS1信息。使用Feature Finder能够确保所有峰都会监测到，包括没有被MS/MS鉴定到的峰和in-silico peptides方法鉴定到的峰。Feature …
本期Protein Metrics Insights的主要内容： (1) 利用In-Silico peptides功能提取一级质谱(MS1)的XIC峰面积； (2) 最新版本Byos V3.7中同时标注去卷积完整谱图中的单同位素分子量和平均分子量。 1. 高级功能 In-Silico Peptides 在默认情况下，Byos大多数肽谱分析流程只对根据MS2谱图匹配到的肽段进行定量分析。有些时候，分析人员也会需要对没有MS2谱图匹配的肽段进行定量。这种情况可以用我们软件的in-silico peptides 功能实现。从广义上来说，in-silico是提取肽段XIC谱图的一种方式。这样即使MS2谱图缺失或者质量差的时候，也可以对肽段进行一致的定量。由In Silico鉴定到的肽段可以通过In Silico列中的“Yes” 标记很容易地与其他MS2鉴定到的肽段区分开。 Automated In-silico Generation via a Theoretical Digest（通过理论酶切自动生成In-silico肽段）: 在创建项目的过程中，软件根据设置的In-silico酶切来生成包含所有预期肽段的列表。理论酶切允许用户查看和编辑修饰列表以满足不同的实验方法。 CSV In-silico Import（导入In-silico肽段的CSV文件）: 项目创建过程中或者项目结束后，都可以导入包含In-silico肽段的CSV文件。 Add Missing via Existing（通过已有的肽段添加缺失肽段）：在一个项目某些文件中找到的肽段，系统可以自动在其他文件中寻找相同肽段的信息。 Create New Peptide from Current（由当前肽段创建新肽段列表）: 在当前已有肽段的基础上生成in-silico列表，可用于添加额外的电荷态和异构修饰。 With the introduction of our new Feature Finder tool（引入新的Feature Finder工具）:用户可以对之前未鉴定的峰进行In-silico鉴定。 打开In-Silico Peptides分析功能的方法是： 在Workflow中的Processing nodes标签页中，找到“In-silico …
