环肽表征解决方案

许多药物，包括环孢菌素，万古霉素等，都是质量为 1000 至 3000 Da 的环状肽或其他受限肽。环肽代表了小分子药物和大分子药物之间的中间立场，通常具有小分子更容易的合成和递送以及大分子的特异性。传统上生物活性环肽是作为天然产物被发现的，但合成生物学和对抗抗生素耐药细菌的需求，正在为加速药物发现提供手段和动力。目前市场上有约 40 种环肽治疗药物，包括抗生素、抗病毒药物和抗真菌药物。但是环肽带来了一些分析上的挑战，包括非核糖体肽（不在基因组中）、非标准氨基酸、大量翻译后修饰 (PTM) 以及二硫键和其他桥。

在这里，我们描述了Byonic^TM中环肽的新搜索模式，系统介绍将环肽转化成线性肽，定义非标准氨基酸以及搜库参数的设置方法等。

环肽定性的难点是缺乏固有的N/C-端和多样化的环化类型，如何在fasta文件中定义环肽的起止残基是搜库成功的关键。Byonic的策略是根据肽键方向（即结构示意图中箭头方向）来线性化环肽，见如下示例：

① 二硫键环化

Somatostatin是通过二硫键（即结构示意图中的曲线）连接的环肽，Byonic将二硫键定义为修饰，可产生1个线性肽，fasta文件如图2所示：

图 1 Somatostatin结构示意图

图 2 Somatostatin线性化序列

② 头尾酰胺化

Unguisin A为环七肽，在每个酰胺键处随机开环，可产生 7 个线性肽；GABA为非标准氨基酸，Byonic可用残基J（精确分子量为100）添加一个固定修饰替代GABA，fasta文件如图4所示：

图 3 Unguisin A结构示意图

图 4 Unguisin A线性化序列

③ 侧链氨基到C端羧基酰胺化

Polymyxin B1含有大量非标准氨基酸Dab（2，4-二氨基丁酸）和1个脂肪酸，Byonic分别用X和J替代Dab残基和脂肪酸残基，fasta文件如图6所示：

图 5 Polymyxin B1结构示意图

图 6 Poymyxin B1线性化序列

④ 侧链羧基到N端氨基酰胺化

Siamycin II是含有2条二硫键的线性化侧链环肽，根据肽键方向，可产生1个线性肽，fasta文件如图8所示：

图 7 Siamycin II结构示意图

图 8 Siamycin II线性化序列

• Protein database options

去掉Add decoys，否则随着环肽复杂性的提高，一些正确的PSMs也会被过滤掉，如图9所示：

图 9 Add decoys参数设置

• 酶切位点

酶切位点设为空白，支持环肽Top-down分析，如下图所示：

图 10 酶切位点参数设置

• 修饰设置

① 二硫键环化：在S-S，Xlink选项下，勾上Disulfides即可；如果氨基酸通过交联试剂偶联，可勾上Crosslink：Custom，按格式输入偶联delta mass和偶联位点即可，如图11所示：

图 11 二硫键环化修饰参数设置

② 头尾酰胺化：Unguisin A含有一个非标准氨基酸GABA，需设为固定修饰；在环肽C端设置脱水的可变修饰，因为环肽可能在体外线性化。这一设置允许Byos搜索所有可能的线性化肽，如图12所示：

图 12 首尾酰胺化修饰参数设置

③ 侧链氨基到C端羧基酰胺化：Polymyxin B1含有FA和Dab 2个非标准氨基酸，分别用J和X代替，并设为固定修饰；启动wildcard search，搜索可能存在的未知修饰，如图13所示：

图 13 侧链氨基到C端羧基酰胺化修饰参数设置

④ 侧链羧基到N端氨基酰胺化：Byonic默认二硫键为rare修饰，Siamycin II含有2个二硫键，需将total rare max改为2，如图14所示：

图 14 侧链羧基到N端氨基酰胺化修饰参数设置

Byos自动选择与图谱匹配最优的线性肽，通常Score值最高。除了b/y离子以外，Byos还自动标识内部片段，如肽AGCKNFFWKTFTSC, i(5-12)表示NFFWKTFT内部片段。注意：在目前商业化版本中内部片段未纳入打分机制中。

图 15 Somatostatin典型MS2光谱

通过 MS2 表征环肽或订书肽比解析线性肽更具挑战性。环肽需要裂解两个主链键才能产生碎片离子，并且缺乏内在的 N 端和 C 端位置使光谱解析变得更加复杂。虽然包括 MSn 方法和/或 UVPD 等替代激活方法在内的多种数据采集模式已证明能够分析这些肽，但工作流程的瓶颈是光谱解析，需要费力的手动分析。

我们已经证明，Byonic^TM在新型环肽模式下运行可以搜索、鉴别和注释环肽。我们预见到将环肽搜索纳入到蛋白质组搜索引擎的优势，如区分环肽和线性化环肽，以及通过wildcard search搜索序列变异体，未知修饰和非标准氨基酸等。