糖肽的RPLC-MS/MS行为 – Binocular Vision

第二期

糖肽的RPLC

-MS/MS行为

Protein Metrics 高准

RPLC行为

离子活化

糖肽裂解规律

分子重排

错误匹配来源

Byos中糖肽结果验证

本文简要介绍糖肽的RPLC-MS/MS行为，主要包括色谱保留，离子活化，质谱裂解规律，分子重排和错误匹配来源等，帮助分析学家快速读懂糖肽LC-MS/MS图谱。

RPLC行为

一个糖肽二级谱往往可以匹配多个不同的聚糖和肽段组合，尤其是当质谱数据质量较差（缺少特征诊断离子或者前体离子测定不正确），保留时间就为糖肽鉴定提供非常重要的互补信息。

糖肽疏水性越强，在RPLC上的保留时间越长。通常糖链上引入中性单糖，如Hex和HexNAc，会增加糖肽亲水性，导致保留减弱。不改变电荷的翻译后修饰，对保留时间影响不大，蛋氨酸氧化除外。有研究发现，如果聚糖链上存在 NeuAc 或磷酸基团，则会导致保留时间增加，因为带负电荷的 NeuAc 和磷酸基团会抵消糖肽质子的正电荷，从而与反相色谱柱更紧密地结合。

离子活化

目前糖肽常用的解离方法有CID，HCD和ETD等，根据需求选择合适的碎裂方法。

CID

由于解离能低和1/3 cut-off，离子阱CID主要产生Y离子，伴有少量的B离子和b/y离子。该技术可识别结合的聚糖，但无法给出准确的糖基化位点和肽序列，可用于简单样品中的糖肽分析。

HCD

HCD可以生成丰富的B/Y互补离子鉴定糖部分；随着碰撞能量增加，b/y系列离子会增多，可鉴定肽部分。研究表明，HCD–MS/MS以20-30-40%的能量可生成信息量最多的聚糖和肽相关碎片离子。

ETD

ETD主要产生c/z离子，可用于鉴定糖基化位点和肽序列。由于ETD效率较低，通常与HCD或者CID结合使用，即EThcD。随着离子触发技术发展，避免了ETD在非糖肽解离上浪费的反应时间。

糖肽裂解规律

在糖质谱命名法中，A/B/C是非还原端离子，X/Y/Z是还原端离子。

B离子是糖肽重要的诊断离子，可用于糖型判断，触发ETD，二级谱过滤等。常见的B离子，如下图所示：

B离子在碰撞池中会发生进一步碎裂，通常会丢失H₂O，CH₂=C=O，HCOH等，我们以HexNAc为例，展示单糖的质谱裂解规律，如下图所示：

在糖肽结构中，往往是糖的还原端与肽段直接相连，因此Y离子由Peptide+Glycan两部分组成。HCD二级谱中Y离子连续的单糖丢失，可用于糖组成和拓扑结构鉴定。

分子重排

质子化糖肽在碰撞池中容易发生分子重排，如单糖迁移（Fuc和其他单糖）和内部残基丢失（可以是单个单糖，也可以是多个单糖，通常以中性碎片形式离去），进一步复杂化糖肽二级谱，导致糖链拓扑结构鉴定错误。全甲基化和乙酰化的糖肽也容易发生分子重排。

Y₂*表示还原端第二个糖丢失，Y₃Y₂*表示还原端第二个和第三个糖丢失。

为了消除重排干扰，可通过去质子化糖肽或者糖肽碱金属加合物来分析糖链结构。研究表明，去质子化和碱金属加合物糖肽在质谱中不会发生重排反应。

错误匹配来源

常见的糖肽匹配错误来源有两个：单同位素峰鉴定错误（如NeuAc与2Fuc质量差为1）和肽段修饰分子量与单糖分子量之差相等（如氧化+NeuAc与NeuGc质量相等）。

Byos中糖肽结果验证

Byos软件提供多个维度自动化的糖肽结果验证指标，如MS1 Correlation，Score，PEP2D等，释放手动解谱压力，使大规模糖肽组分析成为可能。

MS1 Correlation评估实际观测糖肽同位素峰分布与理论同位素峰分布的相关性，降低单同位素峰鉴定错误导致的糖肽错配概率。Byos 3.7及后续版本引入了惩罚性打分，如NeuAc不含有274，NeuGc不含有290等，最小化修饰肽造成糖肽匹配错误。

通常Score与PEP2D搭配使用，Score > 200，PEP2D < 0.001，基本可以保证糖肽鉴定都是正确的。

结语

本文是糖蛋白系列文章第二篇，主要介绍糖肽的RPLC-MS/MS行为，帮助您快速解析糖肽二级谱。后面还有更多精彩内容，敬请期待吧。

参考文献：

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