天冬酰胺脱酰胺定量
天冬酰胺脱酰胺定量 在蛋白质药物中天冬酰胺脱酰胺是一种常见的翻译后修饰，它通常是药物开发过程中强制降解实验考察的重点。许多研究人员在早期研究阶段会去比较不同候选分子的脱酰胺比例并进行筛选，在研究后期对不同批次产品的脱酰胺比例进行比较。总之，无论是出于内部研究的需要还是监管机构的要求，研究人员都需要对蛋白质药物中的脱酰胺进行准确定量。本期文章为大家简单介绍如何在Byos软件中对脱酰胺进行定性和定量分析。 如图1所示，天冬酰胺脱酰胺主要有两种方式：通过水解生成天冬氨酸；首先脱氨形成琥珀酰亚胺，进而开环生成天冬氨酸或者异天冬氨酸。 图1. 天冬酰胺脱酰胺的两种方式 当脱酰胺与未修饰肽段在色谱上有一定程度的共流出时，由于理论上发生脱酰胺的分子量差异是0.984 Da，这种情况下很难对脱酰胺的比例进行准确定量。今天我们介绍下Protein Metrics Byos软件针对脱酰胺的去卷积，定量，报告展示。 我们以IgG1抗体为例，在pH 8.5的条件下分别放置1, 3, 7天。使用Trypsin进行酶切处理，在LTQ-Orbitrap XL(Thermo Fisher)质谱仪上进行数据采集。使用Byos中的PTM workflow对原始数据中的MS/MS谱图进行鉴定，使用肽段的提取离子流图（XIC）峰面积进行定量。脱酰胺与未修饰肽段发生部分共流出，在Byos的搜索结果中，我们可以方便地对共流出情况进行观测。 图2. 发生脱酰胺的…NGQPENNY肽段在Protein Metrics Byos中去卷积前（左）和去卷积后（右）对比图 在图2中左上的XIC图谱实际上是脱酰胺肽段的单同位素峰和未修饰肽段第一个C13同位素峰XIC的总和，右上是在总和的基础上扣除未修饰肽段的结果。 下面我们以IgG1 Trypsin酶切获得的一条常见肽段GFYPSDIAVEWESN387GQPEN392N393YK为例介绍Protein Metrics如何对脱酰胺进行定性和定量。 N392和N393位点脱酰胺分析 为了确认N392位点是否发生脱酰胺，我们在peptide搜索结果中鼠标点击GFYPSDIAVEWESNGQPEnNYK肽段，如图3所示，Byos会在软件对应窗口提供已注释的脱酰胺和未修饰肽段二级质谱图，我们可以用鼠标对图中任意峰进行放大，观察修饰与未修饰肽段碎片例子差异，进而确认修饰位点，从图3可以看出y4离子在脱酰胺肽段与未修饰肽段上有0.984Da差异，进而证明脱酰胺发生于N392位点。 图3. 脱酰胺修饰与未修饰GFYPSDIAVEWESNGQPEnNYK肽段已注释二级质谱图 除了提供已注释二级质谱，Byos可以同时提供修饰和未修饰肽段的XIC 图谱，根据MS2 scan选择合适的积分窗口，如图4所示。图中红色圆点表示当前选择的MS2 scan，粉色圆点表示同一肽段的其他MS2 scan，灰色圆点表示isomer的MS2 scan。 从图上可以看出，保留时间92.5分钟处是N392脱酰胺峰（一个峰）。这与Robinson的报道一致，只有当天冬酰胺的C端为甘氨酸时，会产生琥珀酰亚胺中间体并进一步开环生成异天冬氨酸和天冬氨酸（两个峰），所以N392是通过水解反应直接生成天冬氨酸。当C端为大的疏水性氨基酸如酪氨酸时，一般不易发生脱酰胺修饰，这与本研究相符，在N393上并未发现脱酰胺修饰。 图4. 脱酰胺修饰GFYPSDIAVEWESNGQPEnNYK肽段提取离子流图 如图5和表1所示，Byos可以使用XIC Radio%对多个样本同时进行定量，计算公式如下： 请注意，该公式只考虑单个修饰（比如序列AMNGK发生了氧化和脱酰胺，计算脱酰胺比例时，分母是脱酰胺和未修饰的峰面积；计算氧化比例时，分母是氧化和未修饰的峰面积）。如果肽段含有多个电荷态，该公式会对每个电荷态的XIC Ratio%进行加和或者平均而不是将每个电荷态的峰面积先进行加和或者平均再计算XIC Ratio%。对于脱酰胺，修饰和未修饰肽段均使用单同位素峰定量；对于其他修饰，修饰和未修饰肽段使用相同的同位素峰定量，这个同位素峰取决于未修饰肽段的分子量（Byos默认选择同位素峰簇里响应最高的峰）。 N387位点脱酰胺分析 我们可以用与N392同样的方式对N387位点是否发生脱酰胺修饰进行分析，如图6所示，在y9离子上观察到了0.984Da的差异，证明N387位点发生了脱酰胺修饰。 图6. 脱酰胺修饰和未修饰GFYPSDIAVEWESnGQPENNYK肽段已注释二级质谱对比图 图7. 脱酰胺修饰GFYPSDIAVEWESnGQPENNYK肽段提取离子流图 Byos提取的XIC图谱如图7所示，从图上我们可以看出共有两簇粉色点对应两个峰（91.1分钟和93.25分钟），这说明N387发生脱酰胺后生成了D和isoD，Byos能够对两种形式进行区分和定量，具体操作如图8所示：鼠标右键选择需要进行区分的肽段选择Create new peptide from current…，新建的肽段可以标记为D或者isoD并用于定量，结果见表2。 图8. 从已有肽段创建创建新的肽段示意图 …