亲水作用色谱联用质谱 (Byos®) 在腺相关病毒衣壳蛋白表征中的应用
亲水作用色谱联用质谱 (Byos®) 在腺相关病毒衣壳蛋白表征中的应用 Anita P.Liu、Shailin K.Patel、Tao Xing、Youtian Yan、Shunhai Wang and Ning Li，Regeneron Pharmaceuticals Inc.，Tarrytown，NY，USA 本应用说明概述了我们的研究。 完整研究可通过 Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 网站在线访问。 【优势总结】 本文介绍了一种快速、可靠且灵敏的方法用于确认腺相关病毒 (AAV) 血清型，结合了HILIC分离、荧光检测、精确质量数测定及自动化数据分析。 通过完整衣壳蛋白的分离提供全面表征，以确认血清型种类并评估衣壳蛋白的化学计量和完整性，从而扩展产品知识并确保产品与工艺的一致性。 使用 Byos®进行完整质量分析，确保蛋白组成及其亚型能够准确去卷积并自动定量。 摘要 重组AAV载体因其低免疫原性和低细胞毒性，并能有效转导多种细胞类型，正日益广泛作为基因递送工具用于靶向多种人类疾病[1]。根据目标疾病的不同，需要仔细评估AAV血清型以实现所需的病毒感染性，因为不同血清型表现出不同的组织和细胞嗜性特征[2]。 除了天然存在的AAV血清型外，工程化血清型的数量也在迅速增加，其衣壳氨基酸序列和结构的差异有助于与各种宿主细胞受体的优先相互作用。 为了支持基于AAV的基因治疗开发，我们发现对重组AAV的三种衣壳病毒蛋白(VP; VP1/VP2/VP3) 进行表征，可以深入了解衣壳种类、异质性以及产品和工艺一致性。本文中使用 Protein Metrics 的 Byos 软件平台对原始数据进行表征和分析，提供了高度可靠的结果。 简介 我们开发了一种新型完整蛋白质质量分析方法，用于表征AAV衣壳蛋白。该方法利用了亲水作用色谱 (HILIC) 的独特选择性，并结合了荧光 (FLR) 和质谱检测 (HILIC-FLR-MS)。与反相液相色谱 (RPLC) 相比，我们证明了 HILIC 方法能够更有效地从多种 AAV 血清型中分离三种VP，便于化学计量分析。此外，该方法还能够分离经氧化和磷酸化修饰的衣壳蛋白变异体，这是AAV衣壳中常见的两种PTM。 方法 液相色谱分离在配备光电二极管阵列 (PDA) 检测器和荧光(FLR)检测器的Waters I-Class UPLC系统 (Waters, Milford, MA, USA) 上进行。对于HILIC分离，每种AAV样品取1~3 μL，通过直接进样 (1 μL) 或采用上样策略 (>1 μL) 进样至Waters ACQUITY …