腺相关病毒（AAV）表征：肽图法与完整分子量法的对比
腺相关病毒（AAV）表征： 肽图法与完整分子量法的对比 Application Note 在本应用简报中，我们分别介绍了如何在完整分子量和肽图水平上对AAV进行表征，并快速找到AAV衣壳蛋白的在两种正交实验中差异。 BYOS® 软件内置的重建工具可直接比较肽图法与完整分子量法的结果。 01 前言 腺相关病毒衣壳 (AAVs) 是一种重要的蛋白质工具，可用于尖端基因疗法的研发，进而治疗遗传性视网膜病变和脊肌萎缩等疾病。AAV由一个二十面体蛋白外壳和一个大约4.7千碱基(kb)的单链基因组构成。衣壳由三种病毒蛋白(VPs)构成：VP1、VP2和VP3。完整AAV作为保护和递送寡核苷酸治疗剂的载体。 所有的大分子生物药（包括AAV）都需要监测关键质量属性(CQA)。质谱法可以对翻译后修饰和断裂等CQA进行常规监测。 对于其他CQA（如宿主细胞蛋白残留和氨基酸序列突变），目前主要使用 ELISA 和下一代测序工具等技术进行监测。然而对于此类CQA的定性和定量，正在转由质谱法进行监测，以提供更加深入、快速的信息，帮助工艺研发部门提高产品质量。这一类分析可基于完整蛋白质或肽水平进行。 使用传统的数据分析工具难以直接比较病毒蛋白的在肽图水平和完整蛋白质水平的结果。在本应用简报中，我们展示了Byos中如何直接比较分子量和肽图的实验结果，互相印证，以快速找到样品间差异。 02 材料 AAV8 由Lake Pharma (马萨诸塞州伍斯特）生产。超滤膜和(三(2-羧乙基)膦) (TCEP) 购自Millipore Sigma。胰蛋白酶和rAsp-N均购自Promega。 样品制备 在完整分析时，使用10kDa分子量过滤器对AAV进行了三次缓冲液交换。缓冲液中含有5 mM TCEP、80%水、20%乙腈及0.1%甲酸(v/v)。在收集样本之后、上样之前，将样本在室温下保存。对于肽分析，AAV经历了变性、还原、烷基化和消化。本实验使用的酶为胰蛋白酶和rAsp-N。 03 实验细节 LC/MS分析：LC/MS分析在1290 Infinity II LC上进行，LC与6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF系统相连，LC/Q-TOF系统配有双安捷伦喷射流离子源。Agilent MassHunter Acquisition(B.09.00) 工作站软件进行完整分析。进行了进一步的校准，并在标准质量模式下运行。在肽图分析工作流程中，使用了MS/MS功能。所有质谱数据均采用蛋白质组学ByosTM软件进行处理。 04 讨论与分析 对于完整蛋白和肽肽图这两种正交方法，在样品前处理，色谱参数，质谱采集参数上存在巨大差异，这使得对两种实验的结果进行比较十分困难。ByosTM目前能够深入分析肽图数据，并将其重建为完整分子量去卷积谱图。在分子量实验中，将重建的去卷积谱图与实验获得的去卷积谱图叠加，直接比较完整蛋白和肽肽图这两种正交方法，互相印证数据。 Byos重建功能采用的机制可详见[参考文献1]，其工作原理是将肽图实验获得的翻译后修饰结果进行累加，并覆盖在完整分子量去卷积谱图上(图1)。 图1：VP1数据重建，红线代表特定氨基酸的相对修饰数量并用于绘制理论上蓝色分子量去卷积谱图。重建数据显示，实验获得的去卷积谱图（黑色轮廓）存在肩峰，这是肽图实验中多种低丰度和低质量PTM导致。 尽管肽图重建的去卷积谱图（蓝色轮廓）与完整分子量实验获得的去卷积谱图（黑色轮廓）具有可比性，但很显然的是，在完整分子量水平明显显示的某些组分，在肽图中却缺失了，这代表了翻译后修饰数据中低质量翻译后修饰的结果偏低。 图2：重建表（可由分析人员进行编辑），可用于查看并调整肽图翻译后修饰数据。 若有需要，分析人员还可以查看重建源数据。在这里，用户可以调整条目以查找差异原因，或者在肽水平上发现可能被忽视的翻译后修饰。 能够快速找出同一样本正交实验的差异，有助于提供更准确的结果。在生物药研发过程中，这一点非常重要，在研发过程中尽早找到难点以及不符合期望值所在，从而优化研发周期，节约时间和成本。 图3：VP2数据重建，从重建数据中可以看出在肽图结果中低估了VP1(图2)和VP2中的二磷酸化和三磷酸化的比例。 图4：VP3数据重建，肽图谱数据中的非乙酰化数据被夸大了。这可能是由于断裂导致。 05 结论 BYOS® 软件的重建工具能够快速、简单、直接地比较正交法结果。生成的信息可以迅速为研发人员提供参考，并有助于调查不同分析中出现的差异。能够快速洞察并立即将差异映射到CQA，这一机制有助于公司在工艺研发期间节约大量时间和成本。 …
