针对完整蛋白质分析和色谱工作流程的Trace Peak设置

Protein Metrics

高准编译

自定义洗脱峰设置，

可实现自动峰识别并简化工作流程，

适用于各种类型样品。

Intact, Oligo和Chromatogram模块均有此功能。

• 项目创建过程中的洗脱峰设置

• 导入Trace：嵌入式和非嵌入式Trace

• 选择Trace类型和Trace peak选项

• 自定义Trace peak选项

• 编辑Global Trace peak过滤器

• 创建项目后的洗脱峰设置

• 自定义编辑洗脱峰

• 手动编辑洗脱峰

• 编辑Global Trace peak过滤器

 将原始文件拖放到 Samples Table 中后，任何嵌入式Trace将自动填充到Traces table（图 1）。

图 1.嵌入式Trace自动填充 Traces Table

如果 MS 控制软件未捕获到Trace，请将该Trace导出为 CSV 或TXT格式的 X, Y（强度, 时间）数据，添加到 Samples 选项卡上的对应行，如下所示（图 2）。

图 2.非嵌入式（导出）Trace填充 Traces Table

只需选中 Import Items 复选框，然后选择 Trace Peak Option（Trace peak选项），即可选择要去卷积或导入到项目中的Trace。提供多个可执行去卷积的Trace peak选项，包括 SingleSlice、AutoCompute、CustomSlice(s)、FixedWidthSlice(s) 或 AutoComputeByApex。最后一个选项 ImportOnly 允许导入Trace而不进行去卷积。更多信息详见下文。

图 3.选择去卷积或导入到项目中的Trace

可以在“Edit trace peak options…”按钮下找到自定义Trace peak选项。单击此按钮，将弹出菜单以供自定义。对于以下每项设置，可以将基线自定义为 Auto 或 Flat。在 Auto 基线下，可以设置平滑宽度。此处较大的平滑值可以合并Trace peak，而较小的值可能使峰分裂。 

图 4.自定义Trace peak选项

SingleSlice Trace peak选项将整个样品处理为单个峰，针对每个文件显示一幅去卷积谱图。此设置对于简单的样品或“快速初步浏览”数据非常实用。

图 5.带Trace图示例的 SingleSlice 设置

AutoCompute Trace peak选项是默认的峰识别算法。该峰识别算法基于平滑后的最小宽度来确定Trace peak。此设置将针对每个峰显示一幅去卷积谱图。

为实现理想的峰识别，可能需要自定义平滑宽度和最小宽度。在以下示例中（图 6），将平滑宽度设置为每 0.1 分钟查找一个拐点。最小宽度设置为 0.5 分钟。  对于宽的起伏峰，应增大这些设置。同样，对于窄而尖的峰，可能需要减小这些设置。

图 6.带Trace图示例的 AutoCompute 设置

CustomSlice(s) Trace peak选项使分析人员能够定义开始和结束时间点，针对每个时间点显示一幅去卷积谱图。此设置非常适用于 IdeS 酶解物或预期峰在特定时间窗口内洗脱的样品。

图 7.带Trace图示例的 CustomSlice(s) 设置

FixedWidthSlice(s) Trace peak选项将Trace peak按设定的间隔分开。此设置将针对每个间隔显示一幅去卷积谱图。FixedWidthSlice(s) 非常适用于色谱分离结果不佳的样品（例如 AAV）。

在下面的示例中（图 7），将第一个片段（间隔）设置为 3.25 分钟至 3.50 分钟。将片段之间的步长设置为 0.25 分钟，或与第一个片段相同的持续时间以免片段重叠。请注意，减小片段之间的步长以实现一定程度的重叠，可能有利于特别复杂的样品。最后，将 Number of slices 设置为 10。这相当于 10 个片段，每个 0.25 分钟，或针对 2.5 分钟的片段。

图 8.带Trace图示例的 FixedWidthSlice(s) 设置

AutoComputeByApex Trace peak选项的运行方式与默认 (AutoCompute) 的峰识别算法相同。有关峰识别自定义详细信息，请参见上文。

此设置可以更精细地控制色谱时间范围。这两个选项是“that contains apex within”或“truncated by”。

如果峰肩部或尾部落在指定的时间范围之前或之后，“that contains apex within”将选中整个峰（图 9a）。 

图 9a.带Trace图示例的 AutoComputeByApex 设置 — that contains apex within

或者，“truncated by”设置将执行硬截止，并排除指定时间范围之前或之后的任何峰肩部或尾部（图 9b）。 

图 9b.带Trace图示例的 AutoComputeByApex 设置 — truncated by

 屏幕右下角的“Edit global trace peak filters”按钮可以更全面地控制Trace peak。

峰选项部分允许进行可选的时间截止。此外，可应用最小峰面积阈值来跳过低丰度峰。默认情况下，此阈值设置为 5%。如果发现丢失低丰度峰或片段，则可以将该过滤器调整为更低的百分比，或将其设置为零。

峰比较选项用于批次间样品对比。默认情况下，任何高于或低于参比峰 10 %的Trace peak都将以红色突出显示。

图 10.GlobalTrace peak过滤器

在创建项目后调整所有样品的洗脱峰的最快速、最简单的方法是在 Edit> Recompute trace peaks and baseline… 下进行操作（图 11）。将打开自定义Trace peak的弹出窗口以供调整。Global编辑Trace peak后，转至 Edit> Auto compute，并分配质量数以对Trace进行Global去卷积。

图 11.在创建项目后访问 Recompute trace peaks and baseline 菜单

在一些情况下，有必要手动调整Trace peak。在Trace peak表上方，提供 Add peaks、Delete peaks、Merge peaks 和 Split peaks 按钮。通过单击并编辑Trace peak表中的时间，或拖动Trace图色谱图上的粉色条，可以编辑峰的开始和结束时间。  

图 12.手动编辑洗脱峰

创建项目后，单击Trace peak表上方的放大镜按钮即可访问Global Trace peak过滤器菜单。在这里，可以编辑可选时间范围、最小峰面积阈值和比值标记。

图 13.编辑GlobalTrace peak过滤器