液相色谱-串联质谱 mRNA 序列分析工作流程的优化

方法 — 样品前处理

➢hRNase4 (New England Biologics) 在 U|G 和 U|A 处裂解。 

➢T4 PNK (New England Biologics) 产生均匀的羟基化 3′ 末端。 

➢在 37°C 酶解 40 分钟。 

➢将样品直接进样并在 3% B 下保持 5 分钟以脱盐。

方法 — IPRP-MS/MS

表1：离子对反相(IPRP) 方法摘要

方法 —数据处理

➢本研究中使用的数据处理流程为 Digested Oligo 模块。

➢数据分析使用 Byos™ 和用于 MS/MS 寡核苷酸谱匹配 (OSM) 的特制版 Byonic®。 

➢该解决方案支持所有主要的 MS 供应商数据格式。

图 1. 项目创建窗口允许用户为其特定的仪器和分析定义预期序列和处理参数。

➢工作流程包括 Wildcard Search™、修饰精细控制、OSM 评分和自动/定制报告。

结果 —IPRP 分离

图 2. 使用 Phenomenex bioZen 2.6 um Oligo150 × 2.1 mm 色谱柱分离 hRNAse4 酶解的 eGFP mRNA 所得到的总离子流色谱图。

结果 — 区分异构体

具有不同 mRNA 序列的异构体在寡核苷酸分析中很常见。

可靠的异构体分配至关重要且具有挑战性。

一对示例异构体通过 IPRP 进行分离，并使用我们的数据处理解决方案自动分配（图 3 和 4）。

图 3. 两种分离的异构寡核苷酸的 XIC。在 Byos 中，红点表示分配给当前所选寡核苷酸的 OSM，而灰点表示分配给独特异构体的 OSM。

图 4. 选择用于手动检查分配结果的 Byos 项目研究视图的屏幕截图。各异构体的寡核苷酸谱图均用指定的碎片离子进行标注 (A, B)。显示了寡核苷酸表中的一些列 (C)。

➢观察到异构体区别性碎片离子 y2、w2、y4、b2、d2-18和 d4-18。

➢Delta Score：最佳（已分配）和次佳分配结果之间的 OSM 评分差异。 

➢智能 OSM 评分和 IPRP 分离至关重要。

结果 —自动报告

图 5. eGFP 序列覆盖图，其中黑线表示寡核苷酸 ID。序列覆盖率为 80%（不包括 PolyA 尾部）。

图 6. 包含 OSM 评分和示出Delta Score的热图颜色代码的报告表，对评估分配结果的可靠性非常有用。

图 7. 包含指定的可变修饰的报告表。自动计算修饰与未修饰的相对丰度。

结论

➢采用单一酶解得到的 eGFP 序列覆盖率 (-PolyA) 为 80%。 

➢Digested Oligo 模块为 OSM 分配智能评分和修饰检测。 

➢此工作流程能够分离并自动检测异构体。

致谢：非常感谢 Roxana Eggleston-Rangel 和 Phenomenex 制备样品并采集数据。