微流液相色谱/高分辨质谱法测定生物样品中抗体药物偶联物的药物抗体比
Kazuko Inoue1，Ayako Kurimoto2，
Toshiki Mochizuki1，Nana Kasamori1，
Takafumi Komori1
1Eissai，日本；
2Protein Metrics，美国马萨诸塞州波士顿
摘要：药代动力学研究需要定量体循环中的ADC 上的抗体和药物，因为抗体结合的药物在 ADC 的药理活性中发挥着重要作用。使用配体结合试验法（如 ELISA）可以通过全抗体定量测定生物样品中的 ADC。然而，用于结合 ADC 中有效载荷的人源化抗体通常来源于人 IgG 亚家族，因此难以从血浆或血清等生物样品中分离目标 ADC。
本研究检测了市售沃瑟妥珠单抗 Mc-VC-PAB-MMAE ADC（沃瑟妥珠单抗 MMAE ADC）在血浆（人、食蟹猴和小鼠）中孵育时 DAR 保留的种属特异性差异。
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简介和方法
为了开发适用于 ADC 的预处理和分析工作流程，我们使用了沃瑟妥珠单抗马来酰亚胺基己酰-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基甲基澳瑞他汀 E。
沃瑟妥珠单抗 MMAE ADC 在小鼠、猴、人血浆和 PBS 中于 37℃ 下孵育 0、24、48 和 72 小时，一式三份。为获得生物素化人 CD27 (hCD) 和沃瑟妥珠单抗 MMAE ADC 偶联物，将生物素化 hCD27 与沃瑟妥珠单抗 MMAE ADC 等分试样反应（0、24、48、72 小时）。然后将免疫磁珠 M-280 链霉亲和素悬浮在所得混合物中，并于室温下孵育 15 分钟。使用 Rapid PNGase F 进行磁珠上去糖基化。用乙腈/H2O/甲酸洗脱磁珠上去糖基化的沃瑟妥珠单抗 MMAE ADC。
还原所得洗脱液，然后对还原后的 ADC 进行微流 LC-HRMS 或常规 UFLC-HRMS 分析。使用 Byos 软件处理 HRMS 数据，计算 DAR。
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各变异体和代谢物的DAR计算
图1. 沃瑟妥珠单抗 MMAE ADC 代谢物非常复杂，是连接子水解产物、游离有效载荷以及解偶联的有效载荷连接子的混合物。
图2. Byos ADC 分析参数设置
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结果和结论
图3. 小鼠、猴和人血浆以及 PBS 中沃瑟妥珠单抗 MMAE ADC 的 DAR 保留
沃瑟妥珠单抗 MMAE ADC 在小鼠、猴和人血浆中的 DAR 呈时间依赖性降低。然而，在 PBS 中孵育期间，DAR 保持稳定，表明 ADC 的稳定性取决于生物基质。我们发现 DAR 的稳定性具有种属依赖性，在小鼠中最稳定，其次是人和猴。重链 DAR3 最不稳定，各亚基较低的 DAR 组分呈时间依赖性增加。在小鼠血浆中观察到游离 MMAE 随时间推移增多，并且 MMAE 的释放量与预期 MMAE 释放量（根据测得的 DAR 变化回算）一致。
图4. 沃瑟妥珠单抗 MMAE ADC 在小鼠、猴、人血浆和 PBS 中孵育产生的拟定代谢物
许多解偶联的有效载荷-连接子部分都可以结合猴和人血浆中的血浆蛋白，而不发生水解。Dong 等人的研究曾提到，在人和小鼠血浆中，连接半胱氨酸的 ADC 解偶联后生成的有效载荷-连接子结合白蛋白生成的加合物呈时间依赖性增加，表明白蛋白可能是含有解偶联马来酰亚胺的有效载荷-连接子的重要受体。
· 使用 Byos 可以轻松分析生物样品中的 DAR，提高 ADC 药物开发的准确性。
· 沃瑟妥珠单抗 MMAE ADC 的体内有效载荷释放和 DAR 转换呈种属依赖性。
参考文献：
Inoue, K. et al. Bioanalysis 2022, 14 (24), 1533-1545.
Dong, L. et al. Anal. Chem. 2018, 90, 5989-5994.
作者在此声明，本文不涉及任何竞争性经济利益。
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