本文作者：ProteinMetrics
引言
多特异性抗体是新一代生物治疗药物。其由轻链可变区 (VL) 和重链可变区 (VH) 构成的单链抗体 (scFv) 至关重要，但已知稳定性较低且易发生聚集。
我们团队 (mAbs, 2023) 提出了一种通过VL与VH结构域之间引入两条工程化二硫键进行“缝合”的策略。应用于双特异性抗体的缝合型scFv (称为spFv) 技术实现了更高的热稳定性和极低的聚集倾向。
在此，我们展示了一种改进的工作流程，用来解决对缝合型双特异性抗体进行全面二硫键定位分析所面临的挑战。
图1. 缝合型scFv提升稳定性并减少由“构象呼吸”作用介导的scFv聚集（mAbs，2023）
方法
结果与讨论
Byos结果与检查
二硫键验证
酶切特异性
图2. 基于酶切位点的酶切特异性分析。数据分析首先采用”非特异性酶切”方法，该方法识别出ProAlanase的多个酶切位点，从而证明其非特异性。随后使用半特异性KPA酶切方法进行分析，结果显示酶的特异性有所改善。
质谱采集/缝合型scFv (spFv) 检测
图3. 不同的碎裂模式产生独特的MS2。
A) 质谱仪器设置。
B) ETD、HCD和EThcD谱图示例，展示了预期的位于Cys 41与Cys 116之间的缝合型二硫键连接肽段。
结论
需要建立稳健的二硫键定位分析方法，以确认正确的二硫键连接，并评估是否存在任何潜在的错配二硫键。为此，我们在多个阶段进行了优化：
样品制备
引入双酶（LysC+ProAla）酶切方案。
仪器评估
对新款Orbitrap ExcedionPro BioPharma Hybrid MS系统进行了评估。
数据分析
采用Protein Metrics的二硫键分析流程，提升了对缝合型双特异性抗体中预期缝合二硫键的鉴定能力。
Reference
Boucher, L. E., Prinslow, E. G., Feldkamp, M., Yi, F.. Nanjunda, R., Wu, S. 」.,.. Luo, J.(2023). “Stapling” scFv for multispecific biotherapeutics of superior properties. mAbs, 15(1).
本文作者
Abby J. Chiang1,2, Elsa Gorre2, Alexander N. Barnakov2, Andy Mahan2, Hirsh Nanda2, Reiko Kiyonami3, Min Du3, Cong Wang4, Peter Krueger4
1 Protein Metrics Inc., Boston, MA
2 Johnson & Johnson Innovative Medicine, Spring House, PA
3 Thermo Fisher Scientific, Lexington, MA
4 Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany
作者声明本文不涉及任何利益冲突。
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