使用 Byos 软件的自动标记功能提高数据审查效率

图 2. 当验证器算法部署在 Byos 中时，用于标记序列变异体的逻辑。带有“Critical”标签的序列变异体很可能是误报。带有“Warning”标签的序列变异体应进行手动检查。带有“Clear”标签的序列变异体很可能是真实的阳性结果，并且不需要大量的时间进行审查。RT Diff、ΔPredWT-ΔPredVarRT、ΔModScore, Score和XIC Ratio %的默认阈值如上所示。通过更改高级命令中的值，可以根据分析人员的偏好更改这些阈值。

*注：FWHM 作为最小保留时间差，将修饰分类为不与其野生型共洗脱。设置为 -1 可确定输入文件的平均 FWHM，随后自动计算阈值。或者，可以使用任何大于 0 的实数进行手动设置。

•    使用验证器功能来评估 NIST mAb 的对照和应激样品中序列变异测定的准确性，数据带有为“Critical”、“Warning”和“Clear”标记。

•    使用这些标记，可以快速审查数据并将其标记为误报或真实标识。

•    图 3 显示了项目中生成的标签示例。数据经过筛选后仅显示序列变异体及其相应的未修饰肽段（“野生型”）

图 3：使用默认 Byos 工作流程和通过高级配置选项启用的验证器进行 SVA 的结果。该图表只显示了选择的肽段的相关信息 (A)、所选肽及其野生型的 MS/MS 谱图 (B)、提取离子色谱图 (C) 和 MS 谱图 (D)。每个序列变异体都会在“Comment”列 (A) 中自动标记为“Critical”、“Warning”或“Clear”，以实现快速数据审查并轻松筛选报告数据。此处选择的肽段标签显示 “Clear:No Flags”，由此很容易看出这是一个真正的序列变异体。MS 谱图 (D) 显示了丝氨酸-天冬酰胺置换的预期质量转移（2+ 离子为 13.5）。MS/MS 谱图清楚地显示了 y 离子系列中 y10 处 (B) 变异体和野生型之间的质量迁移，并且变异体的保留时间存在差异 (C)。此外，从这些数据可以看出，很明显该变异体的存在水平比野生型低得多，这符合预期。

•    有许多已知的机制可以在序列变异体分析中轻松标记误报结果。这些问题会生成“Critical”标签，具体如图 2 红色部分所示。

•    无野生型：在受控蛋白质生成中，序列变异体只会出现在产品的很小一部分中。因此，预计会检测到未置换的肽段序列（“野生型”）。如果没有证据表明存在野生型，那么所提出的变异体将被视为错误分配。

•    Off by X=0：允许对前体同位素偏移进行错误检查。在许多仪器上，标称前体质量实际上可能是 13C 同位素峰的质量，而不是基峰（所有 12C 单同位素）的质量。

•    RT Diff < 0.2：由于两种肽之间的氨基酸差异，通常会通过色谱法分离真正的序列变异体及其未修饰的肽序列。野生型肽和检测到的变异体保留时间没有差异，这是 SVA 中误报的自动标记。最小保留时间差的默认设置为 0.2，但用户可以根据需要进行修改。

•    ΔPredWT – ΔPredVar RT < 5：软件可以预测肽段相对于其他肽段（例如野生型“WT”）的洗脱位置。如果此预测明显偏离，则会在“Comment”列中返回严重警告。

•    图 4 显示了“RT Diff < 0.2”的示例。

图 4：使用默认 Byos 工作流程和通过高级配置选项启用的验证器进行 SVA 的结果。屏幕截图只显示了选择的肽段的相关信息(A)、所选肽及其野生型的 MS/MS 谱图 (B)、提取离子色谱图 (C) 和 MS 谱图 (D)。每个序列变异体都会在“Comment”列 (A) 中自动标记为“Critical”、“Warning”或“Clear”，以实现快速数据审查并轻松筛选报告数据。此处选择的肽段标签显示“Critical: RT Diff < Threshold”，由此很容易确定这是一个误报。首先，如标签所示，所提出的变异体和野生型的色谱图谱是相同的 (C)，这对于氨基酸置换来说是非常不寻常的。MS 谱图 (D) 显示单同位素质量（由蓝点表示）较之变异体的峰值小 1 Da，从而表明出现错配。MS/MS 谱图 (B) 显示序列离子之间的差异非常小，并且没有证据表明 y 离子高于 y9。指示变异体任何可能性的 b 离子 (b7) 丰度极低。此外，从这些数据可以看出，很明显所提出的变异体与野生型的数量级相同，这进一步表明出现了错配。

•    使用验证器算法和注释列，可以快速审查数据，从而使用筛选选项消除误报。

•    使用 Byos 修饰验证器，可以按照图 5 所示的逻辑简化排除假标识和验证真实标识的过程。

图 5. 当修饰算法部署在 Byos 中时，用于标记修饰的逻辑。带有“Critical”标签的修饰很可能是误报。带有“Warning”标签的序列变异体应进行手动检查。带有“Clear”标签的序列变异体很可能是真实的阳性结果，并且不需要大量的时间进行审查。

*注：FWHM 作为最小保留时间差，将修饰分类为不与其野生型共洗脱。设置为 -1 可确定输入文件的平均 FWHM，随后自动计算阈值。或者，可以使用任何大于 0 的实数进行手动设置。

•    在与序列变异体分析相同的项目中，验证器功能用于标记 NIST mAb 对照样品和应激样品中的修饰肽段。

•    使用数据标签“Critical”、“Warning”和“Clear”，可以快速审查数据并将其标记为误报或真实标识。

•    图 6 显示了项目中生成的修饰验证器标签的示例。

图 6：使用默认 Byos SVA 工作流程和通过高级配置选项启用的验证器进行 PTM 分析的结果。屏幕截图只显示了选择的肽段的相关信息(A)、所选肽及其野生型的 MS/MS 谱图 (B)、色谱图 (C) 和 MS 谱图 (D)。每个修饰的肽都会在注释列 (A) 中自动标记为“Critical”、“Warning”或“Clear”，以实现快速数据审查并轻松筛选报告数据。此处选择的肽段标签显示“Clear: No Flags”，由此可以看出这是真正的色氨酸氧化。MS 谱图 (D) 显示了预期的氧化质量转移（2+ 离子增加 8 Da）。MS/MS 谱图中的 y 离子系列（图 7 中放大）清楚地显示了氧化肽和野生型 (B) 之间的质量转移，并且正如预期的那样，氧化肽洗脱远远早于野生型 (C)。此示例显示标签为“Clear: No Flags”，表示数据不需要进行人工审查，可以标记为真实结果。

图 7：图 6 中所选肽的 MS/MS 谱图。y 离子系列（从 y5 到 y9）清楚地显示了氧化肽 (A) 和野生型 (B) 之间的质量转移。

•    与 SVA 一样，有许多已知的机制可以在 PTM 分析中轻松标记误报。这些问题会生成“Critical”标签，具体如图 5 所示。

•    图 8 显示了“Critical: RT Diff < Threshold”标记。从所提出的修饰肽段及其未修饰对应物的色谱图中可以清楚地看出，两者之间没有保留时间差。

图 8：使用默认 Byos SVA 工作流程和通过高级配置选项启用的验证器进行 PTM 分析的结果。屏幕截图只显示了选择的肽段的相关信息(A)、所选肽及其野生型的 MS/MS 谱图 (B)、提取离子色谱图 (C) 和 MS 谱图 (D)。这里所提出的氧化肽可以立即被视为错误分配而被驳回，因为它显示标签“Critical: RT Diff < Threshold”。如标签所示，所提出的修饰肽和野生型的色谱图相同 (C)，这表明如果肽段上存在氧化，则它发生在 MS 源中。数据不需要进一步询问，但如果询问的话，没有强有力的支持证据来支持氧化形式。

•    验证器算法自动填充到“Comment”列中的文本极大地简化了数据审查流程，并将审查者引导至需要用户验证的标识。

•    当使用验证器注释审查数据时，序列变异体或修饰可以在 Validate 列中标记为 True-positive、False-positive 或 Uncertain，具体如图 9 所示。

•    在数据审查期间使用“Validate”列表，使用户能够清楚验证数据是否已经过手动检查。Validate 列用于筛选报告，仅查找已由分析人员验证的真实结果。

图 9：使用默认 Byos SVA 工作流程和通过高级配置选项启用的验证器进行 PTM 分析的结果。屏幕截图显示了选择一种肽的肽表。“Validate”列可用于将每个识别标记为“True-positive”、“False-positive”或“Uncertain”。

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